仿生组装淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石骨修复材料的体外释药行为

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.52.007

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (52): 8399-8404.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.52.007

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仿生组装淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石骨修复材料的体外释药行为

吴涛¹，吴金辉¹，郑国栋²，卢志勤¹，曾海燕¹，吕军¹，邢建洲¹

¹广州医科大学附属武警广东省总队医院急诊科，广东省广州市 510507；²广州医科大学药学院，广东省广州市 510182

修回日期:2014-12-01 出版日期:2014-12-17 发布日期:2014-12-17
通讯作者: 邢建洲，副主任医师，广州医科大学附属武警广东省总队医院急诊科，广东省广州市 510507
作者简介:吴涛，男，1979年生，湖南省岳阳市人，汉族，2009年南方医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事骨组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81303107)；广东省自然科学基金(S2012040006295)；广东省医学科研基金(A2012499，A2014499)

Release behavior of icariin-chitosan/hydroxyapatite scaffolds in vitro

Wu Tao¹, Wu Jin-hui¹, Zheng Guo-dong², Lu Zhi-qin¹, Zeng Hai-yan¹, Lv Jun¹, Xing Jian-zhou¹

¹Department of Emergency, Guangdong General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510507, Guangdong Province, China; ²Pharmaceutical College, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China

Revised:2014-12-01 Online:2014-12-17 Published:2014-12-17
Contact: Xing Jian-zhou, Associate chief physician, Department of Emergency, Guangdong General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510507, Guangdong Province, China
About author:Wu Tao, M.D., Attending physician, Department of Emergency, Guangdong General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510507, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81303107; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2012040006295; the Medical Science Research Foundation of Guangdong Province, No. A2012499, A2014499

摘要/Abstract

摘要：

背景：淫羊藿苷性质稳定，可促进成骨细胞的增殖，可作为一种骨诱导活性因子用于骨组织工程的研究。

目的：探讨淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石骨修复材料的体外释药行为。

方法：将载药量分别为10^-⁷，10^-⁶，10^-⁵ mol的淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石材料置于盛有PBS的密闭玻璃离心管中，37 ℃恒温振荡，分别于1，2，3，10，15，20，30，60，90 d定时收集全部溶液进行超高效液相色谱检测。通过精密度实验、重复性实验、加样回收率实验、稳定性实验考查实验方法的精密度、灵敏度和淫羊藿苷的稳定性，通过标准曲线换算供试品每次释药量，并将其进行累积绘制成释药曲线，采用Logarithmic模型对释药行为进行曲线拟合。

结果与结论：实验方法的精密度、准确度与重复性良好；淫羊藿苷性质稳定，可在室温避光的环境下保存至少90 d；在1-2 000 ng质量范围内，淫羊藿苷的色谱峰面积与进样量之间呈良好的线性关系。释药初期(0-3 d)，药物从支架材料中突释，约达载药量的25%，而后释药速度迅速下降，至第20天有40%-60%的药物释出，之后以低速持续释放，90 d后仍有部分药物存留于支架材料中。3种载药量淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石材料的释药行为遵循一级方程模型，所有模型均有统计学意义(P=0)。表明仿生组装淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石骨修复材料对淫羊藿苷具有良好的控释效果，其体外释药行为符合一级方程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 缓释材料, 淫羊藿苷, 壳聚糖, 羟基磷灰石, 支架材料, 控释, 骨, Logarithmic模型, 一级方程, 组织工程, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Icariin has stable nature, which can promote the proliferation of osteoblasts. As a result, it can be used as a new kind of bone induction activity factor for bone tissue engineering.

OBJECTIVE: To study the icariin release behavior of icariin-chitosan/hydroxyapatite scaffolds in vitro.

METHODS: Icariin-chitosan/hydroxyapatite scaffolds (10^-⁷, 10^-⁶, 10^-⁵ mol) were soaked in PBS at 37 °C and shaken gently. The samples collected at 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 60 and 90 days were analyzed by ultra performance liquid chromatography. The precision and sensitivity of ultra performance liquid chromatography were evaluated by precision test, repeatability test, icariin recovery test and stability test. Icariin released from scaffolds was calculated according to the standard curve and the percentage of icariin released was accumulated to draw a release curve which was fitted based on the Logarithmic model.

RESULTS AND CONCLUSION: The precision, accuracy and repeatability of the experimental method were

good, and icariin exhibited a good stability that could be saved darkly at room temperature at least for 90 days. There was a good linear relationship between icariin dose (1-2 000 ng) and chromatographic peak area. At day 1 to day 3, approximately 25% icariin was released; then the release speed was decreased and 40%-60% icariin was released by the end of 20 days. After 90 days, there was still a certain amount of icariin remained in the scaffolds. The release behavior of icariin-chitosan/hydroxyapatite followed the first-order equation, and there were significant difference among all the models (P = 0). These findings indicate that icariin-chitosan/hydroxyapatite scaffolds have a good control effects on icariin release, and the icariin release behavior can be fitted with the first-order equation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: drugs, Chinese herbal, chitosan, hydroxyapatites

中图分类号:

R318

吴涛，吴金辉，郑国栋，卢志勤，曾海燕，吕军，邢建洲. 仿生组装淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石骨修复材料的体外释药行为[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(52): 8399-8404.

Wu Tao, Wu Jin-hui, Zheng Guo-dong, Lu Zhi-qin, Zeng Hai-yan, Lv Jun, Xing Jian-zhou. Release behavior of icariin-chitosan/hydroxyapatite scaffolds in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(52): 8399-8404.

图/表（结果） 3

2.1 线性范围与标准曲线 在1-2 000 ng质量范围内，淫羊藿苷的色谱峰面积与进样量之间呈良好的线性关系，回归方程为：Y = 7 877.254X+ 202 422.5，R² = 0.998 (图1)。

2.2 精密度实验和重复性实验结果 经取同一标准品溶液重复进样测定后淫羊藿苷相对标准偏差为0.636%，表明本法精密度良好；重复性实验的相对标准偏差为3.245%，表明本法重复性良好(表1)。

2.3 淫羊藿苷加样回收率实验结果 淫羊藿苷加样回收率试验结果见表2，平均回收率达96.667%，相对标准偏差为2.139%，说明该结果符合实验要求。

2.4 淫羊藿苷稳定性实验结果 对保存1-90 d的淫羊藿苷进行了稳定性检测(图2)，结果表明，虽然1 000 ng淫羊藿苷在1-90 d内的实测值随时间有部分下降，但是并无统计学意义(F=2.209， P=0.079), ，这说明淫羊藿苷性质稳定，可在室温避光的环境下保存至少90 d。

2.5 淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石复合材料的体外释药行为和分析 对3种载药量的淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石复合材料进行了体外释药行为研究。从UPLC谱图来看(图3)，供试品与对照品溶液均在相同保留时间内出现吸收峰，淫羊藿苷峰保留时间为1.30 min，壳聚糖/羟基磷灰石材料峰保留时间为0.56 min，在淫羊藿苷峰相应位置处无吸收峰(理论塔板数大于11 000)。

通过UPLC图计算淫羊藿苷的峰面积积分值，根据标准曲线换算出每次释药量，再将结果按释药百分率累积得(图4)：在释药初期(0-3 d)，药物从支架材料中爆发性地释放出来，约达载药量的24%；而后释药速度迅速下降，至第20天有40%-65%的药物释出，之后以低速持续释放，90 d后仍有20%-35%的药物存留于支架材料中，这说明淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石复合材料具有良好的控释效果。释药行为拟合曲线结果表明(图5)：3种剂量的淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石复合材料的释药行为遵循一级方程模型，所有模型均有统计学意义(P=0)。

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引言

壳聚糖是甲壳素的脱N-乙酰基的产物。作为一种阳离子型高分子聚合物，壳聚糖可以通过化学交联、静电吸附等作用方式把药物包裹起来，在药物表面形成一层半透膜，药物释放的时候要克服大分子骨架的阻碍，从而显著延长了药物释放时间，达到缓释控释的目的。壳聚糖具有良好的生物相容性，其降解产物为寡聚糖和单糖，终产物为CO₂和H₂O，安全无毒，进入人体后可被人体吸收，且不引发免疫排斥反应；另外，壳聚糖具有较多的侧基官能团，可根据不同临床需要在伯胺基、伯羟基及仲羟基上进行酯化、醚化、氧化、磺化等改性操作，已被广泛用作药物控释载体^[1]。羟基磷灰石是天然骨的主要无机成分，其基本单元-长度为200-400 nm的棒状磷灰石晶体，是发挥骨组织生物学活性的重要结构^[2]。由于羟基磷灰石具有良好的生物活性和生物相容性，植入机体后可发挥良好的骨传导和骨诱导作用，因此已被广泛用于骨组织工程研究。近年来的研究表明，壳聚糖/羟基磷灰石人工骨生物支架材料可构建出满足临床需要的力学强度^[3]，可促进其表面接种骨髓间充质干细胞的增殖和向成骨及软骨细胞的分化^[4]，植入体内后生物相容性好、无毒副作用并可促进局部微血管形成^[5]；通过活化Wnt/β-连环蛋白信号通路，可提高糖尿病动物模型受损细胞的成骨活性，从而加快骨缺损修复^[6]。淫羊藿苷(icariin，C₃₃H₄₀O₁₅，676.67)是一种植物黄酮苷类化合物，由于具有与雌激素相似的分子结构，已作为一种植物雌激素被广泛用于骨质疏松症的研究和治疗^[7]。近年来的研究表明，淫羊藿苷可促进成骨细胞的增殖，并可通过调控BMP、SMAD4和Cbfa1的表达促进成骨细胞的代谢和分化^[8-12]；与此同时，由于淫羊藿苷性质稳定、来源广泛、价格低廉、性质稳定、易于储存、可耐受消毒灭菌^[13-14]，推测淫羊藿苷可作为一种骨诱导活性因子用于骨组织工程研究。在前期研究中，课题组采用原位复合和冷冻干燥技术仿生构建了淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石骨修复材料，体内骨修复实验证明，该复合材料具有良好的生物相容性和骨诱导活性，可提高植入部位骨组织的再生速度，从而促进兔骨缺损模型的修复效果^[15-16]，但尚未对其体外释药行为进行系统研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：样本观察实验。

时间及地点：于2014年6至12月在南方医科大学实验中心完成。

材料：

实验方法：

淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石材料的制备：称取一定量的淫羊藿苷溶于无水乙醇，将其与壳聚糖加入体积分数2%的乙酸溶液中，搅拌2 h后每隔1 h按Ca/P=1.67分别加入一定质量的Ca(NO₃)₂•4H₂O 和KH₂PO₄，最终配成壳聚糖/羟基磷灰石前体溶液(其中壳聚糖浓度为2.5%，壳聚糖/羟基磷灰石理论生成量质量比为1∶2)，继续搅拌4 h，离心去气泡，然后注入模具，4 ℃冰箱静置6 h后放入-10 ℃冷冻3 h，再进行冻干燥。于室温下将样品在含饱和淫羊藿苷的4% NaOH去离子水中浸泡10 h，继而用含饱和淫羊藿苷的去离子水反复浸洗至中性，再次进行冷冻和冷冻干燥得到所需样品。依此法制备载药量分别为10^-⁷，10^-⁶，10^-⁵ mol的Φ4×15 mm³圆柱形淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石复合材料。

淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石复合材料供试溶液的制备：将Φ4×15 mm³圆柱形淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石材料置于盛有5 mL PBS(pH=7.4)的密闭玻璃离心管中，37 ℃恒温振荡，10 r/min离心，分别于1，2，3，10，15，20，30，60，90 d定时收集全部溶液，4 ℃密封储存以备检测，同时补足等体积的PBS。检测时，离心取0.5 mL上清于另一离心管中，加入0.5 mL乙腈涡漩1 min，16 000 r/min离心10 min，再取上清10 μL过膜，超高效液相色谱仪上机检测。取不含淫羊藿苷的壳聚糖/羟基磷灰石支架材料，按上述方法制备阴性对照品溶液。

色谱条件：Acquity UPLCTM色谱系统，色谱柱为Acquity UPLCTM BEH C18 色谱柱 (1.7 μm，2.1 mm×50 mm)，检测器为二极管阵列检测器(PDA)，流动相乙腈-1%乙酸水(30∶70)；流速为0.25 mL/min，柱温30 ℃，检测波长270 nm，进样量10 μL。

淫羊藿苷标准品溶液的配制：精密称取淫羊藿苷标准品(40目过筛，60 ℃烘4 h)100 mg，置25 mL容量瓶中，加无水甲醇溶解并定容，摇匀，配制成质量浓度为10 g/L的淫羊藿苷储备液，依次稀释成200，100，50，10，0.1 mg/L系列浓度标准液，置于4 ℃冰箱中贮存，备用。

标准曲线和线性关系考察：取上述各标准品溶液10 μL，依次进样，记录色谱图，按上述色谱条件测得峰面积，以淫羊藿苷对照品进样量X(ng)为横坐标，峰面积值Y为纵坐标绘制标准曲线。

精密度实验：精密吸取同一标准品溶液(100 µg/L) 10 μL，重复进样6次，测定淫羊藿苷的峰面积值。

重复性实验：取同批供试样品6份，10 μL进样，测定淫羊藿苷峰面积值。

加样回收率实验：取含100，150，200 ng淫羊藿苷的标准品溶液，加入已测淫羊藿苷含量的供试品中，进样20 μL，以外标法计算含量和回收率。

稳定性实验：分别于UPLC测试的前1，10，20，30，60、90 d精密称取一定量的淫羊藿苷，无水甲醇溶解后用PBS(pH=7.4)稀释成100 mg/L，室温避光静置，检测时以10 μL进样。

主要观察指标：淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石骨修复材料的体外释药行为。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，以P < 0.05为差异有显著性意义，用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。采用线性回归制作标准曲线，稳定性实验数据同一组别不同时间点的比较采用One-Way ANOVA进行分析，采用Logarithmic模型对释药行为进行曲线拟合。

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讨论

对药物进行良好的缓/控释是材料研究的重要方面，无论是采取物理吸附、包裹，还是表面改性，均是为了在局部维持有效药物浓度，从而更好地诱导组织再生^[17-21]。以往的组织工程支架材料，由于骨形态发生蛋白等生长因子因在性能和结构上的不稳定，往往只能通过简单浸渍或包

裹的方法与生物材料进行复合，控释效果不甚理想^[22-26]。本实验中支架材料的制备方法同简单的物理吸附、包裹法相比具有明显的不同：淫羊藿苷首先以乙醇溶解形式掺入材料前体溶液，通过搅拌获得均匀一致的分散体，后续的冷冻干燥和浸洗过程带走乙醇，材料内留存的药物被纳米羟基磷灰石吸附、壳聚糖形成的结构包裹或储留于材料细微的间隙，这种方法制备的支架材料载药均匀，便于对载药剂量进行精确控制。当支架材料与释放介质接触时，壳聚糖吸水膨胀，位于壳聚糖浅表网络中的药物被首先释放出来，因此在释药早期(0-3 d)会发生突释现象；当溶胀达到平衡后，药物只能通过网络空间缓慢扩散或通过材料的降解而释放，此时的释药行为遵守扩散控制机制，释药速度减慢，这都与体外实验观察到的情况相一致。此外，材料中的纳米羟基磷灰石粒子具有巨大的比表面积(达200-500 m²/g)也可能对释药行为发生一定影响：药物在纳米粒子表面存在一个吸附-解吸附过程，若粒子表面积较大，则药物的解吸附需要克服较大的分子间力才能从粒子表面扩散出去，从而增加药物释放时间^[27-29]。

缓释和控释制剂的释药过程可以用不同方程进行曲线拟合，主要有一级方程、Higuchi方程、零级方程等^[30-31]。二者的主要区别在于缓释制剂是按时间变化先多后少地非恒速释放，而控释制剂是按零级速率规律释放，即其释药是不受时间影响的恒速释放。虽然理想缓控释材料的释药速率应该符合零级动力学方程(即恒速释放)，但在实际缓控释制剂的研究中，能够真正达到零级释药的制剂却是很少，常见的缓控释材料的药物释放模式主要分为两类^[32-34]：①以零级或缓慢的一级速度释放药物。②有一快速释放的起始量，然后再以慢的零级或一级释放维持剂量。缓释制剂的释药数据可用一级方程[ln(1-M_t/M_∞)=-kt]和Higuchi方程[M_t/M_∞=kt^1/2]进行拟合，控释制剂的释药数据可用零级方程 [M_t/M_∞=kt]进行拟合，上式中，M_t为t间的累积释放量；M_∞为∞时累积释放量；M_t/M_∞为t时累积释放百分率。本实验采用SPSS软件对淫羊藿苷的释药行为进行了拟合。3种载药支架释药方程分别为(=0-90 d)淫羊藿苷载药量为10^-⁷mol时，Y=6.267+13.468 ln(X)，R²=0.901；淫羊藿苷载药量为10^-⁶ mol时, Y=5.668+16.846 ln(X) R²=0.916；淫羊藿苷载药量为10^-⁵ mol时，Y=6.322+18.466 ln(X) R²=0.923。

一般药物的释放大概分为3种方式：在一段时间内匀速释放；在较长时间内以某种方式周期性的释放；在环境或其他外部因素的刺激下触发式的释放。药物从控制释放体系中释放的机制有扩散、溶胀后扩散以及降解等。基于对壳聚糖的溶胀性和溶解性的研究，分析其药物释放应该为溶胀后扩散释放。从复合支架的初期到放在37 ℃的PBS环境中释放这一过程中，壳聚糖逐步吸水溶胀，药物逐渐溶解，通过扩散作用先扩散到支架内的水环境中，最后通过复合支架材料的孔隙扩散到PBS中，分析其释放主要分为两个阶段：第一阶段，在淫羊藿苷释放的开始3 d内，药物的累计释放量迅速增加，释放曲线直线上升。这主要是因为支架材料表面吸附了较多的药物，释放初期首先释放的是表面吸附的药物，由于吸附在支架材料表面的药物或者与纳米羟基磷灰石结合力较弱的药物短时间内从微粒表面脱落，引起药物浓度的急剧上升。该过程主要是通过表面扩散的方式释放，这时释放速度快，造成了突释现象，这一阶段叫扩散释放。第二阶段，在释放3 d后，就是被吸附的药物的扩散释放和壳聚糖降解引起的释放，相对于第一阶段释放速度明显趋于平缓，上升幅度较小，而且释放时间较长，可持续释放90 d，该过程由扩散过程与降解过程共同控制，叫扩散-降解释放。

结合释药拟合曲线来看，淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石复合材料的整体释药行为符合一级方程，虽然在释药早期(0-3 d)发生了突释，但之后释药速度明显减低，释药规律接近零级，至90 d后仍有20%以上的药物存留于支架材料中；对于不同载药量的支架材料，药物释放规律基本相同，这些都证明淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石复合材料具有良好的缓/控释效果。

以壳聚糖/羟基磷灰石复合支架为药物载体，采用原位复合技术制备了载淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石复合药物缓释支架。由于中药淫羊藿苷单体的化学性质稳定，所以淫羊藿苷的载入对壳聚糖/羟基磷灰石的性能不会产生不良影响。此外，在制备载药支架过程中，依据前期工作确定的淫羊藿苷安全、有效药物浓度对材料的载药剂量进行精确控制，因此这种载药复合支架无细胞毒性，具有良好的生物相容性。通过体外药物释放实验证明壳聚糖/羟基磷灰石对淫羊藿苷具有良好的缓控释性能，因此淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石复合支架是一种理想的骨修复的多孔材料，这也为临床应用研究提供了理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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仿生组装淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石骨修复材料的体外释药行为

Release behavior of icariin-chitosan/hydroxyapatite scaffolds in vitro

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